什么是荧光？

       荧光是一种光致发光过程。光致发光是一种物质吸收特定波长的光，然后再发射更长波长的光（通常是可见光或近可见光）的现象。这种发射光称为光致发光发射。

发光

       了解发光现象有助于解释荧光和磷光。发光是指发光系统从高能状态转变为低能状态时发出的光。物体可以通过施加电流（电致发光）、放射性轰击（放射性发光）以及用光源照射物体（光致发光）来激发，从而产生高能状态，这是光谱实验室中最常见的情况。有时光的发射是化学反应（化学发光）或生化反应（生物发光）的结果。

有些现象不属于发光范畴。由于加热而发光（白炽）不是发光过程，需要与热释光过程（加热后重新发光）区分开来。

光致发光、发射和吸收

当化合物受到电磁辐射照射时，部分辐射会被吸收。根据所涉及的能量，这种吸收可以触发几种不同的过程：

      ·最低能量辐射——微波辐射——会诱导化合物沿其轴旋转。

      ·红外线 (IR) 和近红外 (NIR) 辐射的吸收会引起化合物的振动。

      ·可见光（Vis）和紫外线（UV）辐射的吸收导致电子达到更高的状态。

       对于所有这些过程，吸收的光必须具有系统达到更高能态所需的能量。不同的化合物在其能态之间具有非常具体的“间隙”，从而产生独特的发射和吸收光谱（图 1）。吸收光谱测量这些能态分布，为我们提供有关电子激发态的信息。

                                                                           图 1.光致发光过程中分子中发生的进程。

       “激发”的化合物可以通过与溶剂分子碰撞等方式将能量释放到分子环境中。或者，它可以通过以光的形式释放能量返回基态。这就是发光过程。

      光的发射无需任何外部触发（自发发射），这与受激发射（例如激光）截然不同。发射光（荧光）的能量通常低于吸收光的能量。因此，吸收带和发射带通常以图像和镜像的形式出现（图 1）。最低能量吸收带的最大值与最高能量发射带的最大值之间的能量差称为“斯托克斯位移”（图 2）。

                                                              图2.斯托克斯位移这一术语描述了吸收和发射之间的能量差异。

什么是荧光光谱？

       在荧光光谱法中，用单色光（通常是紫外线或可见光）照射样品，其能量可被样品化合物吸收。样品吸收这些激发光子，将分子从基态激发到激发电子态。然后分子回到基态，产生的能量以光子的形式发射出来，导致分子发出荧光。检测和分析这些光子的强度和频率，并利用这些信息确定分子振动能级的结构（见图 1）。这可以告诉我们分子是什么，有多少分子，分子是否在发生任何变化，分子如何与同一样品中的其他分子相互作用，等等。由此产生的应用非常广泛，将在后面的常见问题解答中讨论。

荧光光谱学主要涉及分析样品荧光，但其大部分内容也适用于磷光。

荧光光谱和样品浓度

荧光光谱法最重要的应用之一是测定未知样品的浓度。为此，我们需要了解样品浓度与其荧光信号强度之间的关系。那么，是什么决定了样品的荧光强度呢？

荧光信号取决于激发化合物的数量（图 3）以及描述激发态分子开始发光的可能性的常数，这是有道理的。

                                                                 F ≈ 𝝓 • （激发态分子数）

                                                                          图3.荧光强度与样品中激发分子的数量成正比。

   这个常数 ( 𝝓 ) 称为荧光量子产率，描述的是化合物发射光子与吸收光子的比率。化合物的量子产率越高，荧光性越强。

达到激发态的分子数量在很大程度上取决于光源的强度。照射到样品上的光越多，吸收的光就越多。但这也取决于化合物吸收光的能力。这种吸收一定能量光的能力由化合物的吸收系数 ( ε ) 描述，这构成了吸收光谱的基础。

这意味着达到激发态的分子数量可以描述为到达样品的光 (I ₀ ) 与穿过样品的光 (I) 之间的强度差。

                                                                                      （达到激发态的分子数）= I ₀ – I

利用朗伯比尔定律（I = I ₀ • 10 ^- εl c），样品后的强度可以重写为：

                                                                                      （激发态分子数）= I ₀ – I ₀ • 10 ^- ε lc = I ₀ • (1-10 ^- ε l c )

                                                                                        最后：F = 𝝓 • I ₀ • (1-10 ^- ε l c )

   因此，朗伯比尔定律将荧光信号强度与样品浓度联系起来。然而，这种关系只对稀释样品呈线性（图 4）。如果光密度 (OD) 小于 0.05，荧光信号与浓度保持线性关系（在每本关于荧光的“最佳实践”书中都可以找到 0.05 的 OD）。

   非线性信号-浓度关系仍可用于根据荧光强度确定未知样品的浓度。然而，在这种情况下，需要非常小心地构建校准曲线并注意这个问题。

图 4 . 荧光强度与样品浓度/光密度 (OD) 的关系不是线性的。荧光强度随浓度 (蓝色) 呈指数增加，偏离线性曲线 (红色)。对于稀释样品 (OD < ~0.05)，浓度和荧光强度之间的关系在近似值上呈线性。线性曲线 (红色) 和“真实”指数 (蓝色) 曲线在 OD 高达 0.05 时基本相同。

荧光光谱的主要原理是什么？

这些常见问题解答中更详细地描述了荧光光谱的主要原理，但可以总结如下：

• 吸收和激发——分子吸收光能，促使电子达到更高的能级。
• 荧光发射——分子将吸收的能量以较长波长的光形式释放。
• 斯托克斯位移——吸收光和发射光之间的能量差异揭示了分子特性。
• 量子产率——测量发射光与吸收光相比的效率。
• 荧光寿命——分子在返回基态之前保持激发态的平均时间。
• 强度和光谱——荧光强度和发射光谱可以提供样品特性的见解。
• 猝灭和FRET——由于分子间或分子内相互作用或能量转移导致荧光减弱。
• 荧光各向异性——测量发射光的偏振，表明分子运动或能量转移。
  

  荧光光谱有哪些类型？

  荧光光谱法有很多变体，每种变体都旨在研究荧光分子及其相互作用的不同方面。一些主要类型包括：

  • 稳态荧光— 最常见的类型。照射样品并测量发射光强度与波长的关系，提供有关荧光分子量子产率和浓度的信息。此类别可进一步分为共振和非共振荧光。共振荧光的发射波长与激发波长相同，而非共振荧光的发射波长与激发波长不同（通常更高）。安捷伦Cary Eclipse 的双单色器、双滤光片、90 度检测设计和超亮氙气闪光灯非常适合这两种应用。
  • 时间分辨荧光— 研究荧光发射随时间衰减的情况。它提供有关荧光寿命的信息，可用于研究分子动力学、能量转移和相互作用。时间分辨荧光通常需要非常快速的检测系统才能准确捕获发射曲线，而 Cary Eclipse 的采集速率可达 1 μs (1 MHz)。对于超过 50 μs 的寿命，可以获得良好的结果，对于 100 μs 及以上的表征寿命，可以获得高度可信的结果。
  • 各向异性光谱— 测量发射光的偏振，以研究分子运动、旋转动力学和结合相互作用。Cary Eclipse 特别适用于研究生物分子及其相互作用，它既有专用的自动偏振器，也有手动偏振器附件，非常适合此类测量。
  • FRET 光谱— 研究供体荧光团和受体荧光团之间的能量转移。用于研究分子相互作用、构象变化和分子间距离。这些研究通常需要高精度的温度控制。我们市场领先的Cary Eclipse Peltier 温度控制器能够实现 ±0.05°C 的长期稳定性，温度范围为 -10°C 至 100°C，非常适合这项任务。
  • 荧光相关光谱 (FCS) — 分析小体积中的分子扩散和相互作用。提供有关分子迁移率、浓度和结合动力学的信息。这些研究的理想配件包括RX2000 快速混合配件和SFA-20 停流配件，两者均适用于 Cary Eclipse。这些配件提供了极好的实时记录荧光的方法，同时将少量两种试剂快速混合在一起。
  • 单分子荧光——研究单个分子，提供对单分子水平上的异质性、动态和相互作用的洞察。
  • FLIM（荧光寿命成像显微镜） ——将荧光显微镜与时间分辨荧光相结合，以可视化基于荧光寿命的相互作用和过程。
  • TIRF（全内反射荧光） ——使用衰减波照明选择性地激发表面附近的荧光团。常用于研究细胞膜上或细胞膜附近发生的过程。

• 荧光光谱法有哪些应用？

  荧光光谱法是学术研究和实际应用中的一项有用技术。荧光光谱法提供有关分子电子状态（例如能量、极性）以及光吸收后发生的过程（例如能量转移、松弛、系统间交叉）及其时间尺度的详细信息。这些信息不仅具有学术意义，而且在选择 LED 或太阳能电池等光电设备的材料时也很重要。除了用于研究给定分子的光谱特性外，荧光光谱法还可用作分析工具。请继续阅读或参阅我们的荧光光谱应用指南以获取更多详细信息。

  荧光光谱应用大致可分为两大类：化学和材料（包括学术界）以及生命科学。近年来，后者荧光仪器的使用量大幅增长，尤其是在细胞分析等应用中。

  有些分子天生就具有荧光性。其他分子则被设计为在特定条件下以特定方式发出荧光，并且是为非常特定的用途而合成的。荧光材料包括：

  • 蛋白质和肽（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）
  • 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）
  • 核黄素
  • 叶绿素
  • 量子点
  • 奎宁
  • 方解石、磷灰石、刚玉等矿物
  • 荧光染料，如罗丹明、BODIPY、荧光素

     

  化学品和材料应用

  荧光光谱法是一种用于监测涉及荧光反应物和/或产物的反应的技术，该技术的优点包括灵活的采样（例如，使用光纤探头直接在反应烧瓶中测量）和极快的扫描速率，可用于分析短寿命物质。涉及荧光材料的更具体应用包括：

  • 测量洗衣粉中荧光增白剂的荧光
  • 测量钟乳石和活珊瑚等复杂固体样品的荧光
  • 表征新合成材料的发射以了解其电子特性（用于光电应用）
  • 多环芳烃的检测和水中溶解有机碳的分析

     

  生命科学应用

  生命科学应用受益于荧光光谱的多功能性，它能够进行动力学测量、检测细胞内离子浓度、使用偏振滤光片分析分子的旋转运动以及精细控制样品温度。示例应用包括：

  • 表征活细胞成像的生物标签
  • 表征 GPCR 寡聚化
  • 使用荧光测定法检测特定细菌菌株
  • 利用细胞信号了解血小板反应
  • 分析蛋白质三级结构的变化
  • 确定生物催化剂和药物的热稳定性
  • 确定 DNA 和 RNA 样本的熔化温度 (Tm)
  • 识别聚集的生物分子，例如单克隆抗体
  • 测定细胞内分析物浓度
  • 荧光免疫测定的读数

• 荧光光谱法有哪些优点？

  荧光光谱法具有显著的优势，使得荧光光谱仪成为大多数光谱实验室中不可或缺的分析工具：

  • 荧光光谱法非常灵敏。在大多数情况下，它比吸收光谱法灵敏约 1,000 倍。例如，使用 Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计检测荧光的极限已确定为 0.48 pM。
  • 荧光光谱法是非破坏性的。在大多数情况下，样品在荧光实验后仍保持完整，这与质谱法等技术不同。在极少数情况下，高能紫外线会使样品光降解，但在这方面，Cary Eclipse是大多数其他荧光分光光度计的例外。由于 Eclipse 中装有氙气闪光灯，因此只有在进行测量时才会照亮样品，从而消除了光降解。
  • 荧光光谱具有高度选择性。在荧光实验中，我们有两种分析波长——激发波长和发射波长。只有吸收激发光并发射特定波长光的化合物才会被检测到。所有其他不吸收入射光或发射不同波长光的化合物都不会对收集的信号产生影响。这样，我们就可以非常有选择性地只分析我们感兴趣的化合物。
  • 荧光光谱法信息量很大。荧光实验可以提供定性和定量信息：
    • 浓度：荧光信号与样品中发射物质的浓度相关。
    • 检测：荧光光谱非常灵敏，可以检测到物质的最小痕迹。
    • 表征：发射光谱提供有关电子基态的信息，激发光谱提供有关电子激发态的信息。
    • 样品环境：许多发色团的发射会根据温度、pH 值或溶剂（溶剂致变色）等因素发生变化。这种效应可用于监测发色团周围环境的变化（例如，构象变化过程中极性的变化可能导致发射光的能量或强度发生变化）。
    • 过程：荧光有助于了解激发后发生的过程。偏振测量有助于揭示聚集或能量转移过程。猝灭研究通常用于生命科学，以研究蛋白质和 DNA/RNA（标记）行为。
  • 荧光光谱法用途广泛。荧光仪器可以进行各种荧光测量，以及磷光、化学发光和生物发光测量。添加合适的附件可以使这些仪器更加灵活。Cary Eclipse 荧光分光光度计可以与一系列用于液体、固体、粉末和糊状物的附件配合使用，包括：
    • 用于方法开发或高通量测量的微孔板读数仪
    • 光纤探头和耦合器无需比色皿即可进行快速、准确的测量
    • 帕尔帖和水恒温单池和多池支架，用于精确的温度控制
    • 温度探头可精确测量比色皿内部的温度
    • 快速混合附件，用于研究在几秒内完成的超快动力学测量
    • 手动和自动偏振器，激发波长低至 275 nm
    • 固体样品支架，用于获取多种样品类型的荧光光谱，包括过滤器、粉末、凝胶、光学元件和织物
    • 光纤反射探头和耦合器

  • 荧光光谱法的缺点是什么？

    荧光光谱法虽然是一种强大的技术，但也存在某些缺点：

    • 自发荧光/生物发光/化学发光——一些样本，尤其是生物样本，会因内源性荧光团而自然发出荧光，这可能会干扰目标分子的分析。然而，Cary Eclipse 有一个专门的“生物发光/化学发光”模式，可以测量天然荧光物质。此模式会禁用样本的激发，而是记录其天然荧光曲线。
    • 光漂白— 持续暴露于激发光会导致光漂白，样品的荧光强度会随着时间的推移而减弱，从而影响测量的可靠性。 Cary Eclipse 通过使用氙气闪光灯光源来缓解这一问题，该光源以 80 Hz 的频率闪烁（而稳定状态的灯则一直亮着）。此外，该灯仅在数据采集期间闪烁，否则保持熄灭状态。
    • 穿透深度有限— 与红外技术相比，荧光技术以及一般的 UV-Vis-NIR 技术穿透深度有限。这使得它们不太适合厚度较大或不透明度较高的样品。
    • 环境敏感性——荧光对温度、pH 值和溶剂成分等环境因素敏感，这些因素会影响分子的荧光特性。
    • 样本复杂性——在复杂样本中，可能会出现重叠的荧光信号，而且由于许多荧光发射的光谱很宽，区分单个信号可能具有挑战性——导致数据解释的模糊性。
    • 荧光团附着效应——在分子上添加荧光标签可能会改变其特性、相互作用或行为，从而可能引入伪影。
    • 猝灭和相互作用——荧光可以通过与其他分子的相互作用而被猝灭（减少），并且这种相互作用可能并不总是容易解释的。
    • 伪影生成——错误的样品制备、不适当的标记方法或仪器设置可能会产生扭曲结果的伪影。
    • 高选择性——荧光的高选择性无疑是有利的；然而，它也可能是一个缺点，因为很少有分子天生会发出荧光。这使得荧光无法轻松、广泛地应用于分子光谱学的所有领域。

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