HPLC 是高效液相色谱法的缩写。“色谱法”是一种分离技术，“色谱图”是色谱法的结果，“色谱仪”是进行色谱法的仪器。

在色谱分析技术的发展中，用于分子分离的专用装置（色谱柱）和以稳定流速输送溶剂的高性能泵是色谱分析仪器的关键部件。随着相关技术的日益成熟，通常称为高效液相色谱分析的系统被简称为“LC”。如今，能够进行高速分析的超高效液相色谱分析（UHPLC）也越来越普及。

只有溶解在溶剂中的化合物才能用 HPLC 进行分析。HPLC 分离溶解在液体样品中的化合物，并可以定性和定量分析样品中含有哪些成分以及每种成分的含量。

图 1 显示了 HPLC 过程的基本概述。用于分离液体样品中成分以进行 HPLC 分析的溶剂称为流动相。流动相被输送到分离柱（也称为固定相），然后以由溶剂输送泵控制的稳定流速输送到检测器。将一定量的样品注入柱中，分离样品中所含的化合物。分离在柱中的化合物由柱下游的检测器检测，并识别和量化每种化合物。

2 色谱装置

至此，我们已经介绍了“HPLC 流程的基本概述”（如图 1 所示）及其机制。更详细地说，HPLC 由多种组件组成，包括溶剂输送泵、脱气装置、进样器、柱温箱、检测器和数据处理器。图 2 显示了 HPLC 流程图和每个组件的作用。

对于 HPLC，泵以受控流速输送流动相 (a)。在我们生活的标准大气压下，空气很容易溶解在流动相中。如果流动相中含有气泡并进入输送泵，可能会出现流速波动和基线噪声/漂移等问题。脱气装置通过去除流动相中的气泡来帮助防止此问题 (b)。溶解的空气被去除后，流动相被输送到色谱柱中。然后，样品注射器将标准溶液或样品溶液引入流动相 (c)。温度波动会影响色谱柱中化合物的分离。色谱柱放在色谱柱炉中以保持温度恒定 (d)。从色谱柱中洗脱的化合物由位于色谱柱下游的检测器检测 (e)。工作站处理来自检测器的信号以获得色谱图以识别和量化化合物 (f)。

3 HPLC 分离

HPLC是利用各化合物通过色谱柱的速度差异，对各化合物进行分离检测的。图3为HPLC分离的一个例子。

HPLC 有两个相：流动相和固定相。流动相是溶解目标化合物的液体。固定相是色谱柱中与目标化合物相互作用的部分。

在色谱柱中，组分与流动相的亲和力（例如范德华力）越强，组分随流动相通过色谱柱的速度就越快。另一方面，与固定相的亲和力越强，组分通过色谱柱的速度就越慢。图 3 显示了一个例子，其中黄色组分与流动相的亲和力强，在色谱柱中移动得很快，而粉色组分与固定相的亲和力强，在色谱柱中移动得很慢。色谱柱中的洗脱速度取决于化合物与固定相之间的亲和力。

4 梯度洗脱与等度洗脱

如果流动相的组成在整个 HPLC 分离过程中保持不变，则该分离被视为等度洗脱。通常，在合理的时间内洗脱样品中的所有化合物同时仍保持峰分辨率的唯一方法是在样品运行期间改变流动相中极性化合物与非极性化合物的比例。这种技术称为梯度色谱法，当样品含有各种极性的成分时，它是首选技术。对于反相梯度，溶剂开始时相对极性，然后慢慢变得更加非极性。梯度洗脱可最完全地分离峰，而无需花费过多的时间。含有各种极性化合物的样品可以通过梯度洗脱在更短的时间内分离，而不会损失早期峰的分辨率或过度加宽后期峰。但是，梯度洗脱需要更复杂和昂贵的设备，并且在流动相组成不断变化的情况下更难保持恒定的流速。梯度洗脱，尤其是高速洗脱，会暴露出低质量实验设备的局限性，使得在易变的设备中获得的结果更难重现。如果流速或流动相成分波动，结果将无法重现。

应用

HPLC 既可用于定性应用，也可用于定量应用，即既可用于化合物鉴定，也可用于定量。目前正相 HPLC 很少使用，几乎所有的 HPLC 分离都可以在反相中进行。反相 HPLC (RPLC) 仅在少数几种分离类型中无效；它不能分离无机离子（它们可以通过离子交换色谱分离）。它不能分离多糖（它们太亲水，无法发生任何固相吸附），也不能分离多核苷酸（它们不可逆地吸附到反相填料上）。最后，极疏水的化合物不能通过 RPLC 有效分离（选择性很低）。除了这几个例外，RPLC 用于分离几乎所有其他化合物种类。RPLC 可用于有效分离类似的简单和芳香烃，甚至那些仅相差一个亚甲基的烃。RPLC 可有效分离简单的胺、糖、脂质，甚至药物活性化合物。RPLC 还用于分离氨基酸、肽和蛋白质。最后，RPLC 用于分离生物来源的分子。在商业应用中，咖啡产品中的咖啡因含量测定通常由 RPLC 进行，以保证研磨咖啡的纯度和质量。HPLC 是分析工具库的有用补充，尤其是用于在进一步分析之前分离样品。

5 如何读色谱图

“色谱图”一词是指通过色谱法获得的图。图 4 显示了色谱图的示例。色谱图是一个二维图，纵轴表示检测器信号强度的浓度，横轴表示分析时间。当没有化合物从色谱柱中洗脱时，绘制一条与横轴平行的线。这被称为基线。检测器根据洗脱带中目标化合物的浓度做出响应。获得的图更像是钟形而不是三角形。这种形状称为“峰”。

保留时间（tR）是样品注入点与峰顶点之间的时间间隔。非保留化合物（与固定相无相互作用的化合物）从注入器到检测器所需的时间称为死时间（t0）。

峰高（h）为峰顶与基线的垂直距离，淡蓝色表示的峰面积（A）为峰与基线所围成的面积。这些结果可用于样品成分的定性和定量分析。